KTV NGUYỄN ĐÀO HIẾU – Khoa HHTM

I. ĐẠI CƯƠNG

Vi rút là một trong những nguyên nhân gây ra một số bệnh nghiêm trọng ở người. Trong đó vi rút viêm gan B (HBV: Hepatitis B virus), vi rút viêm gan C (HCV: Hepatitis C virus), vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV: Human immunodeficiency virus) là vi rút gây bệnh thông qua đường máu. Các vi rút này biến đổi liên tục về cấu trúc và hệ gen để trốn thoát các loại sinh phẩm xét nghiệm, hậu quả là tăng tỷ lệ lây nhiễm trong cộng đồng.

Hình 1: Hệ thống Cobas s 201 phiên bản 2.0 tại Khoa Huyết học- Truyền máu BVĐK Quảng Nam

Phương pháp xét nghiệm dùng cho sàng lọc HIV, HBV và HCV trong truyền máu là xác định tác nhân gây bệnh gián tiếp dựa trên kết quả của phản ứng miễn dịch “kháng nguyên-kháng thể”. Ưu điểm của xét nghiệm là đơn giản, tốn ít thời gian, giá thành hợp lý, song phương pháp này có nhược điểm là trong giai đoạn “cửa sổ” khi đó kháng thể hoặc kháng nguyên chưa đạt ngưỡng phát hiện, do vậy xét nghiệm sẽ cho ra kết quả âm tính. Bên cạnh đó, tương tác không đặc hiệu của kháng thể hoặc kháng nguyên với những bất thường protein khác trong máu có cấu trúc gần giống với kháng nguyên hoặc kháng thể có thể dẫn đến kết quả dương tính giả. Cùng với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, kỹ thuật NAT đã được đưa vào sử dụng, kỹ thuật này có độ nhạy cao cho phép phát hiện và nhân bản đặc hiệu theo hàm mũ các trình tự đích của tác nhân gây bệnh từ một lượng nhỏ vi rút, do đó, cho phép phát hiện sớm và chính xác các tác nhân gây bệnh. Hơn thế nữa, NAT có thể được sử dụng để phát hiện đồng thời HIV, HBV và HCV thông qua một xét nghiệm trong thời gian là 4-5 giờ, đảm bảo an toàn cho đơn vị máu truyền.

Trên thế giới, khi sàng lọc máu, các nước phát triển thực hiện song song giữa phương pháp xét nghiệm gián tiếp kháng nguyên – kháng thể và xét nghiệm NAT cho đơn vị máu từ cuối những năm 1990 đầu những năm 2000. Ở Việt Nam, hầu hết các phòng xét nghiệm sàng lọc HIV, HBV và HCV đều sử dụng phương pháp xét nghiệm miễn dịch kháng nguyên kháng thể hay còn gọi là xét nghiệm huyết thanh học, xét nghiệm NAT chưa được sử dụng. Đến năm 2015, Viện HHTMTW thực hiện theo Thông tư 26 TT-BYT ngày 16/9/2013 hướng dẫn hoạt động truyền máu, triển khai xét nghiệm NAT đảm bảo an toàn truyền máu.

II XÉT NGHIỆM NAT

NAT (nucleic acid test) hay NAAT (nucleic acid amplification test) là kỹ thuật sinh học phân tử dùng trong chẩn đoán, mục tiêu của xét nghiệm là phát hiện sự có mặt vật liệu di truyền (RNA hoặc DNA) của tác nhân gây bệnh tồn tại trong mẫu nghiệm qua đó xác định sự hiện diện của tác nhân gây bệnh. Tùy vào mục đích mà có những ứng dụng kỹ thuật khác nhau, các nhóm kỹ thuật phổ biến là:

• PCR (polymerase chain reaction)
• LCR (Ligase chain reaction)
• bDNA (Branched DNA)
• NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification)
• TMA (Transcription mediated amplification)

Xét nghiệm NAT có nhiều ưu điểm như:

• Có thể phát hiện nồng độ rất thấp RNA hay DNA (10copys/ml).
• Rút ngắn thời gian cửa sổ trong xét nghiệm sàng lọc an toàn truyền máu vì nó có thể phát hiện tác nhân gây bệnh trong thời kỳ ủ bệnh.
• Có khả năng phát hiện được các chủng đột biến cũng như thể ẩn vi rút.
• Độ nhạy và độ đặc hiệu cực cao đối với a xít nucleic của vi rút.

Trong xét nghiệm sàng lọc cho an toàn truyền máu, xét nghiệm NAT có thể rút ngắn thời gian của sổ phát hiện so với các kỹ thuật miễn dịch. Tuy nhiên, nó không thể thay thể hoàn toàn được cho các xét nghiệm này do có những thời điểm xét nghiệm NAT không thể phát hiện DNA hay RNA vi rút trong mẫu người hiến máu, ví dụ khi cơ thể sinh ra nhiều kháng thể trung hòa hết toàn bộ vi rút trong máu thì xét nghiệm NAT sẽ âm tính, trong khi các xét nghiệm miễn dịch vẫn có thể phát hiện được.

Hiện nay, hai kỹ thuật đang được ứng dụng phổ biến trong xét nghiệm sàng lọc máu ở Việt Nam và trên thế giới là RT-PCR (Real time PCR) và TMA.

1. Xét nghiệm PCR

PCR là một thử nghiệm dựa trên cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (thường là Taq polymerase) để khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc trưng với các thành phần chủ yếu của phản ứng là: (1) enzyme polymerase chịu nhiệt, có hoạt tính tối đa ở 72oC và bền được với nhiệt độ; (2) 4 loại desoxyribonucleotide (dNTP) là Adenine, Thymine, Guanine, và Cytosine (dATP, dTTP, dGTP, dCTP); (3) DNA chứa các đoạn DNA đích sẽ được nhân bản trong ống phản ứng; (4) các đoạn mồi (primer) xuôi và ngược là các đoạn oligonucleotide có chiều dài khoảng 20 - 30 nucleotide có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của 2 đầu đoạn DNA sẽ được nhân bản; (5) ion Mg2+ trong muối MgCl­­2 ở nồng độ thích hợp, (6) dung dịch đệm Tris-KCl để làm dung môi thích hợp cho phản ứng. Khi ống nghiệm phản ứng này được cho vào buồng ủ chu kỳ nhiệt của máy luân nhiệt (thermal cycler), mà chúng ta thường gọi là máy PCR, chương trình nhiệt độ trong máy sẽ làm cho nhiệt độ trong buồng ủ nhiệt của máy thay đổi theo chu kỳ, nhờ vậy mà phản ứng nhân bản DNA sẽ xảy ra.

Nguyên lý

Về mặt nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm 3 giai đoạn nhiệt độ. (1) Đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 94oC, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn; giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn biến tính. (2) Kế đó nhiệt độ sẽ được hạ đến 55oC- 65oC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích, giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn bắt cặp. (3) Cuối cùng, nhiệt độ được đưa lên 72oC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzyme Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung. Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao. Phát hiện các sản phẩm khuếch đại này bằng phương pháp điện di và nhuộm màu.

Hình 2: Nguyên tắc PCR là nhân bản qua các chu kỳ nhiệt

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng nhờ tín hiệu huỳnh quang, chính vì vậy nên được gọi là real-time; và do đặc điểm này nên với real-time PCR người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc và phân tích kết quả để xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không vì kết quả cuối cùng của phản ứng khuếch đại cũng được hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng khuếch đại. Như vậy, có thể nói real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được.

2. Hệ thống xét nghiệm Cobas s 201

2.1. Phạm vi sử dụng

Xét nghiệm định tính in vitro phát hiện trực tiếp acid nucleic trong huyết tương người:

• RNA của HIV-1 Nhóm M,
• RNA của HIV-1 nhóm O,
• RNA của HIV-2,
• RNA của HCV,
• DNA của HBV

Mẫu có thể được xét nghiệm dưới dạng mẫu đơn lẻ hay mẫu gộp từ nhiều túi mẫu máu ban đầu và được đánh giá cùng với các xét nghiệm huyết thanh học.

Mẫu huyết tương được sử dụng có nguồn gốc từ túi máu hiến hoặc mẫu máu từ người đã ngưng tim.

Không được dùng cho mục đích chẩn đoán tác nhân nhiễm.

2.2. Nguyên lý: Xét nghiệm cobas s 201 dựa trên 4 quy trình chính:

+ Phân phối/ hút mẫu và hút mẫu chứng tự động sử dụng máy hút mẫu Hamilton Microlab Star/Starlet IDV tùy chọn (POOLING Mẫu).

Hình 3: Máy hút mẫu Hamilton Microlab Star/Starlet IDV

+ Chuẩn bị mẫu tự động dùng máy COBAS AmpliPrep (CAP).

Hình 4: Máy COBAS AmpliPrep (CAP)

+ Khuếch đại tự động Acid Nucleic và phát hiện thời gian thực động và phân biệt các sản phẩm PCR sử dụng máy COBAS TaqMan (CTM).

Hình 5: Máy COBAS TaqMan (CTM)

+ Quản lý dữ liệu tự động dùng phần mềm tập hợp và quản lý dữ liệu (PDM)  

Hình 6: Phần mềm quản lý dữ liệu (PDM)

III KẾT LUẬN

Kỹ thuật xét nghiệm NAT có ưu điểm nổi bật là độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao, do phát hiện trực tiếp ADN hoặc ARN của vi rút; xác định axít nucleic của vi rút theo các trình tự đặc hiệu; giúp phát hiện vi rút ở giai đoạn cửa sổ từ lúc phơi. Theo các nghiên cứu trên thế giới, so với xét nghiệm sàng lọc huyết thanh, kỹ thuật NAT giúp rút ngắn giai đoạn cửa sổ từ 82 xuống 23 ngày đối với vi rút HCV; từ 59 xuống 34 ngày đối với vi rút HBV và từ 21 xuống 11 ngày đối với vi rút HIV. Ngoài ra, trước đây, các máy móc thông thường chỉ xét nghiệm được 120 mẫu với thời gian sáu tiếng, thì một lần xét nghiệm NAT đã được 520 mẫu, thời gian chỉ mất ba đến bốn tiếng.

Năm 2015, cả nước tiếp nhận được 1.160.726 đơn vị máu toàn phần và khối tiểu cầu gạn tách từ một người hiến. Trong đó, ngoài việc xét nghiệm sàng lọc cho 100% đơn vị máu bằng kỹ thuật huyết thanh học phát hiện nhiễm vi rút HBV, HCV, HIV, giang mai, sốt rét… Trong đó, bước đầu thực hiện xét nghiệm sàng lọc bằng kỹ thuật NAT cho 417.893 mẫu máu (đạt 36% tổng số máu tiếp nhận và sử dụng (417.893/1.160.726), phát hiện được 442 mẫu máu nhiễm bệnh. Ước tính xét nghiệm NAT có thể phát hiện được mẫu nhiễm HBV là 1/1.184 mẫu, HCV là 1/37.990 mẫu, với HIV là 1/83.579 mẫu đã có xét nghiệm huyết thanh học âm tính trước đó.

Theo đánh giá của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), truyền máu là một trong ba yếu tố đánh giá sự phát triển y tế của mỗi quốc gia. Cả nước dự kiến tiếp nhận khoảng 1,3 triệu vào năm 2016 và đạt 1,8 triệu đơn vị máu năm 2020. Do vậy, việc đảm bảo an toàn truyền máu luôn được đặt lên hàng đầu, trong đó xét nghiệm sàng lọc máu, bảo đảm an toàn truyền máu là một trong những yếu tố quan trọng bậc nhất góp phần đạt được mục tiêu này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bạch Khánh Hòa, Nguyễn Anh Trí (2008), Ứng dụng kỹ thuật NAT để phát hiện sớm HIV, HBV, HCV ở người cho máu, Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp Bộ.
2. Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Minh Thi, Nguyễn Thị Lệ (2005), Giáo trình Sinh học phân tử, NXB Đại học Huế.
3. Phạm Hùng Vân (2009), PCR và real-time PCR: Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, Nhà Xuất Bản Y Học.
4. Bộ Y tế (2013), Thông tư số 26/2013/TT-BYT ngày 16/09/2013 Hướng dẫn hoạt động truyền máu.
5. Bộ Y tế (2013), Thông tư số 15/2013/TT-BY ngày 24/05/2013 Hướng dẫn bảo đảm chất lựợng thực hiện kỹ thuật xét nghiệm HIV.
6. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M (1989). "Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome", Science, 244 (4902): pp 359-62.
7. Bernard. P, Dipak. D, Syamalyma. D, Jayne. L, Lawrence. P ( 2000 ), “HTLV II associated cutanous T-cell lymphoma in a patient with HIV 1 infection”, The New England journal of Medicine 342, pp 930-936.
8. Decker et al. (1997), Hepatitis C 1997: Essay and Expert Opinions on its Natural History, Epidermiology, Diagnosis and Therapy. Abbott Diagnostics Division.
9. Giulio Pisani, Karen Cristiano, Simonetta Pupell, and Giancarlo Maria Liumbruno (2016), “West Nile Virus in Europe and Safety of Blood Transfusion”, Transfus Medicine and Hemother, 43(3), pp 158-167.
10. Marano G, Vaglio S, Pupella S, Facco G, Catalano L, Piccinini V, Liumbruno GM, Grazzini G (2016), “Human T-lymphotropic virus and transfusion safety: does one size fit all?”, Transfusion, 56(1): pp 249-60.
11. Marja E.Koivenen, et al (2006). “Principles of Immunochemical Techniques Used in Clinical Laboratories”, Laboratory Medicine Volume 37 Number 8, pp 490-497.
12. Pooria Gill1, Amir Ghaemi (2008), “Nucleic acid isothermal amplification technologies - a review”, Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, 27: pp 224-243.